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解析細胞MTT的用途及原理

更新時間:2014-10-11 點擊量:723

解析細胞MTT的用途及原理

MTT主要有兩個用途:

.藥物(也包括其他處理方式如放射線照射)對體外培養的細胞毒性的測定;

2.細胞增殖及細胞活性測定。

檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲臜(Formazan)并沉積在細胞中,而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲臜,用酶標儀在490nm波長處測定其光吸收值,在一定細胞數范圍內,MTT結晶形成的量與細胞數成正比。根據測得的吸光度值(OD值),來判斷活細胞數量,OD 值越大,細胞活性越強(如果是測藥物毒性,則表示藥物毒性越小)。

貼壁細胞

、收集對數期細胞,調整細胞懸液濃度,每孔加入00ul,鋪板使待測細胞調密度至000-0000孔,(邊緣孔用無菌PBS填充)。

2.、5%CO2,37℃孵育,至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),加入濃度梯度的藥物,原則上,細胞貼壁后即可加藥,或兩小時,或半天時間,但我們常在前一天下午鋪板,次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔00ul,設3-5個復孔.建議設5個,否則難以反應真實情況

3、5%CO2,37℃孵育6-48小時,倒置顯微鏡下觀察。

4、每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),繼續培養4h。若藥物與MTT能夠反應,可先離心后棄去培養液,小心用PBS沖2-3遍后,再加入含MTT的培養液。

5、終止培養,小心吸去孔內培養液。

6、每孔加入50ul二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩0min,使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。

7、同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜),對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜)。

懸浮細胞

、收集對數期細胞,調節細胞懸液濃度×06/ml,按次序將①補足的640(無血清)培養基40ul ;②加Actinomycin D(有毒性)0ul用培養液稀釋 (儲存液00mg/ml,需預試尋找*稀釋度,:0-:20);③需檢測物0ul;④細胞懸液50ul(即5×04cell/孔),共 00ul加入到96孔板(邊緣孔用無菌水填充)。每板設對照(加00ml 640)。

2、置37℃,5%CO2孵育6-48小時,倒置顯微鏡下觀察。

3、每孔加入0 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5%MTT),繼續培養4 h。(懸浮細胞使用WST-,培養4 h后可跳過步驟4),直接酶聯免疫檢測儀OD570nm(630nm校準)測量各孔的吸光值)

4、離心(000轉x0min),小心吸掉上清,每孔加入00 ul二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩0 min,使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570nm(630nm校準)測量各孔的吸光值。

5、同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜),對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜),每組設定3復孔。

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