.  血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心0分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。ELISA試劑盒

2.  血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.  細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心0分鐘去除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心0分鐘取上清。

5.  保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

小鼠c-Jun氨基末端激酶（JNK）操作步驟

  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
  設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；
  樣本孔先加待測(cè)樣本0μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不加。
  除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體00μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
  棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。
  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育5min。
  每孔加入終止液50μL，5min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

結(jié)果判斷

 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)，按曲線(xiàn)方程計(jì)算各樣本濃度值。ELISA試劑盒

此時(shí)酶催化無(wú)色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。在定量測(cè)定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。ELISA試劑盒時(shí)間一般不需要嚴(yán)格控制，有時(shí)可根據(jù)陽(yáng)性對(duì)照孔和陰性對(duì)照孔的顯色情況適當(dāng)縮短或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，及時(shí)判斷。
OPD底物顯色一般在室外溫或37 ℃反應(yīng)20-30分鐘后即不再加深，再延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會(huì)自行變色，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進(jìn)行，顯色反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入終止液終止反應(yīng)。OPD產(chǎn)物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。
    TMB受光照的影響不大，ELISA試劑盒可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)，隨即逐漸減弱，至2小時(shí)后即可*消退至無(wú)色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類(lèi)終止劑尚能使藍(lán)色維持較長(zhǎng)時(shí)間（2-24小時(shí)）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類(lèi)酸性終止液則會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色，此時(shí)可用特定的波長(zhǎng)（450 nm）測(cè)讀吸光值。
（2）比色
    比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，ELISA試劑盒然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗(yàn)，需先將板置于標(biāo)準(zhǔn)96孔的座架中，才可進(jìn)行比色。在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可*平妥坐入座架中。ELISA試劑盒