雙抗夾心 ELISA試劑盒的反應(yīng)時間

   在保證 ELISA 有效檢測病原菌的前提下，快速、方 便也是雙抗夾心 ELISA 的必要條件。雙抗夾心 ELISA 從 加入待測抗原到得出結(jié)果，檢測大腸桿菌 O57:H7 共需 要 5h 左右，而間接 ELISA 則需要 7h(包被 37℃，2h)或 者 7h(包被 4℃guo夜)。本論文篩選出的雙抗夾心 ELISA 檢測大腸桿菌 O57:H7 省去封閉這一步驟。在間接 ELISA 測定抗原中，封閉一般是*的，因為包 被不同濃度抗原不一定可以*覆蓋固相載體表面，如 果不封閉，很可能使隨后加入的特異性抗體和酶標(biāo)二抗 直接被吸附到固相載體上，產(chǎn)生非特異性顯色而使檢測 結(jié)果偏高。但是對于雙抗體夾心 ELISA 來說，在包被 捕獲抗體時已經(jīng)使固相載體飽和，已經(jīng)沒有多余的吸附 力來吸附隨后加入的特異性抗體和酶標(biāo)二抗，這都說明 了雙抗夾心 ELISA 有不需要封閉的可能，通過正交試驗 結(jié)果也證明不封閉可以達到理想實驗效果，而且還縮短 了整個檢測流程和時間，說明只要酶標(biāo)記物是高活性的 并且操作時洗滌*，不經(jīng)封閉也可得到滿意結(jié)果。雙抗夾心 ELISA 檢測法的特異性和靈敏性 抗原抗體的結(jié)合實際上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點之間，由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空 間構(gòu)型上呈互補關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特 異性。但這種特異性并不是的，假使兩種化合物 有著部分相同的結(jié)構(gòu)，在抗原抗體反應(yīng)中可能出現(xiàn)交叉 反應(yīng)。本實驗以大腸桿菌 O57:H7 及其他菌株共 0 株作 為抗原用來檢測本方法的特異性，結(jié)果顯示大腸桿菌 O57:H7 呈明顯陽性反應(yīng)，其余各菌株均呈陰性反應(yīng)， 說明本方法對大腸桿菌 O57:H7 具有明顯的檢測特異 性，而對所測定的其它菌株無交叉反應(yīng)。

   本論文所建立的雙抗夾心 ELISA 方法對純培養(yǎng)的 大腸桿菌 O57:H7 檢出限均05CFU/ml，Kerr 和 Chart 等[6]建立的雙抗夾心 ELISA 檢測大腸桿菌 O57:H7 的檢測限為 0 5 CFU/ml ，趙志晶和劉秀梅[7] 建立的雙抗夾心ELISA 檢測大腸桿菌 O57:H7 的檢測限為 04CFU/ml，兩 者均用單克隆抗體作為檢測抗體，而本方法使用 IgY 抗 體與兔多克隆抗體，制備相對比單克隆抗體簡單，對試 劑、成本要求也相對降低，其效果基本達到檢測要求。